화학공학소재연구정보센터
  • SAClA로 단백질의 유황원자를 이용한 결정구조 결정에 성공등록일 : 2015/12/01
  • ~ 제약 대상이 되는 다양한 단백질의 미지 입체구조 해석이 가능 ~

    이화학연구소 방사광과학종합연구센터 SACLA 이용기술개척그룹과 도쿄대학 대학원 이학계연구과, 오사카대학 단백질연구소 단백질해석첨단연구센터, 고휘도광과학연구센터 XFEL이용연구추진실 등 연구그룹은 X선자유전자레이저(XFEL) 시설 ‘SACLA’의 X선 레이저를 이용한 SFX에서는 지금까지 과제이었던 시료의 방사선 손상이 발생하지 않고 마이크로미터 크기 이하의 단백질 미소결정에서도 입체구조를 결정할 수 있었다.

    원자분해능에서 단백질 3차원 입체 구조는 그 기능을 이해하기 위한 중요한 정보원이 된다. 그 입체 구조를 결정하려면 단백질 결정을 이용한 X선 결정구조 해석이 적합하다. 대형 방사광시설인 ‘SPring-8’의 방사광을 이용할 경우, 일반적으로 약 30마이크로미터(μm) 이상의 단백질 결정이 필요하다. 그러나 30μm 이상인 단백질 결정을 얻는 것은 곤란하고 특히 제약 등의 연구 용도에서 중요한 인간을 포함하는 동물성 단백질은 결정화에 사용할 수 있을 만큼 충분한 양을 얻는 것이 어렵다. 석출할 결정도 회절실험에 적합한 충분한 크기로 성장하지 않는다.

    X선 자유전자레이저(XFEL, X-ray Free-Electron Laser)는 SPring-8의 방사광보다 10억 배 밝기 때문에 마이크로미터(μm)나 그 이하 크기의 단백질 미소결정으로도 구조 해석이 가능하다. 현재 가동 중인 XFEL 시설로는 이화학연구소의 ‘SACLA’와 미국의 SLAC국립 가속 연구소인 ‘LCLS(Linac Coherent Light Source)’가 있으며, 또한 유럽, 아시아에서 XFEL 시설 건설 계획이 진행 중이다.

    SACLA의 10펨토 초 이하라는 초 단시간으로 X선 레이저를 조사하면 단백질이 붕괴되기 전에 미결정 회절 이미지를 검출할 수 있다. 이 XFEL의 특성을 이용한 주요 단백질 구조 결정법으로서 연속 펨토 초 결정구조 해석(SFX, Serial Femtosecond Crystallography)이 주목받고 있다. 주로 제트 인젝터라고 불리는 장치에서 분출한 다수의 미소 결정을 포함한 액체에 X선 레이저를 조사하여 각 결정으로부터 회절 데이터를 연속적으로 수집한다. SFX는 상온에서 실험할 수 있기 때문에 종래 저온 조건 하(100K 정도)에서 실시한 회절 실험과는 달리 생리조건(생체적)에 가까운 구조를 얻을 수 있다.

    X선 결정구조 해석은 목적 단백질과 비슷한 구조가 이미 있는 경우, 분자 치환법이라는 구조 결정법을 이용한다. 한편, 유사한 구조가 없는 경우에는 단백질에 수은, 백금 등의 중원자를 결합시키고 그 중원자의 이상 분산효과를 이용하여 구조결정을 행하는 방법을 이용한다. 그러나 단백질에 따라 결합할 중원자를 발견하지 못한 경우나 중원자화에 의해 결정에 손상을 주는 경우가 있다. 그럴 경우에는 단백질이 가지고 있는 아미노산의 셀렌, 시스테인의 황원자를 이용한 단파장 이상 분산법(S-SAD법)을 이용할 수 있다. S-SAD법은 단백질이 가진 황원자를 이용하기 때문에 얻어진 결정을 그대로 사용할 수 있다는 이점이 있지만, 중원자와 비교했을 때 매우 약한 황원자의 이상 분산 신호를 이용하기 때문에 SN비가 좋은 많은 회절 이미지를 수집할 필요가 있다. 본 연구에서는 SACLA의 X선 레이저를 이용한 SFX로 S-SAD법에 의한 첫 단백질 구조 결정을 시도하였다.

    공동 연구그룹은 지금까지 SFX에서 샘플 공급방법으로서 ‘그리스 매트릭스법’ 개발에 성공했다. 종래 제트 인젝터를 이용한 샘플 공급은 구조를 결정하기 위해 10~100mg의 단백질이 필요했으나 그리스 매트릭스법에서는 저속에서 샘플을 흘려보낼 수 있기 때문에 그 결과, 1mg 이하의 샘플로도 구조결정이 가능하다. 본 연구는 그리스 매트릭스법을 이용하여 측정 파장 1.77옹스트롱으로 크기 약 7~10μm의 라이소자임 결정으로부터 회절 분해능 2.1Å의 회절 데이터를 수집했다.

    6시간 정도의 측정 시간으로 구조해석에 이용 가능한 180,000장의 회절 이미지를 수집하여 그 중 150,000매 이미지를 사용하는 것으로 S-SAD법에 의한 라이소자임의 결정구조 결정에 성공했다. 이것에 의해 SACLA의 X선 레이저와 그리스 매트릭스법을 사용함으로써 S-SAD법에 의한 구조결정에 충분한 정도의 회절 이미지를 수집할 수 있다는 점을 실증했다.

    그림 1. SFX에서 사용한 라이소자임 결정
    그림 2. S-SAD법에 의해 결정한 라이소자임 단백질 결정 구조

  • 키워드 : 단백질, 유황, 결정구조
  • 출처 : KISTI 미리안 글로벌동향브리핑